Cara Kerja Elisa CGMMV

Cara Kerja Elisa CGMMV (Cucumber Green Mottle Mosaic Virus)
Berdasar Protokol Agdia CAB 45701

1.       Siapkan peta well.

2.       Siapkan humid box (kotak tertutup berisi kertas towel basah).

3.       Siapkan larutan capture antibody (capture antibody ditambah carbonate coating buffer)

·         Carbonate coating buffer : 10x konsentrasi

·         Capture antibody : 200x konsentrasi

·         Tiap well memerlukan 100 µl larutan capture antibody

·         Sesuaikan perhitungan dengan jumlah well

·         Aduk merata

4.       Masukkan 100 µl capture antibody ke dalam tiap well sesuai peta.

5.       Masukkan plate ke dalam humid box, inkubasi 4°C semalam atau 4 jam pada suhu ruang.

6.       Cuci plate

·         Buang isi well dengan cepat

·         Isi well dengan larutan PBST. Buang dengan cepat, lalu tepuk-tepukkan pada kertas towel

·         Ulangi 2x lagi

7.       Siapkan larutan GEB

·         Komposisi : Buffer powder (16,5) g + Tween 20 (10ml) + aquades steril (500 ml)

8.       Siapkan sampel

·         Timbang 1 g daun bergejala

·         Gerus dalam plastik berisi 2 ml larutan GEB sampai halus

·         Tambahkan 8 ml larutan GEB, campur dengan menekan plastik

9.       Siapkan kontrol positif, kontrol negatif dan buffer (GEB).

10.   Masukkan 100 µl sampel, kontrol positif, kontrol negatif dan buffer ke dalam well sesuai peta.

11.   Masukkan plate ke dalam humid box, inkubasi 4°C semalam atau 2 jam pada suhu ruang.

12.   Cuci plate

·         Buang isi well dengan cepat

·         Isi well dengan larutan PBST. Buang dengan cepat, lalu tepuk-tepukkan pada kertas towel

·         Ulangi 7x lagi

13.   Siapkan larutan enzyme conjugate (alkaline phosphat enzyme conjugate ditambah ECl buffer) sepuluh menit sebelum digunakan.

·         Alkaline phosphat enzyme conjugate : 200x konsentrasi

·         ECl buffer : 5x konsentrasi

·         Tiap well memerlukan 100 µl larutan enzyme conjugate

·         Sesuaikan perhitungan dengan jumlah well

·         Aduk merata

14.   Masukkan 100 µl enzyme conjugate ke dalam tiap well sesuai peta, tunggu 5 menit.

15.   Inkubasi plate dalam humid box selama 2 jam pada suhu ruang.

16.   Siapkan larutan PNP 1mg/ml, 15 menit sebelum inkubasi berakhir

·         Tablet PNP :  5 mg/tablet

·         PNP substrate buffer : 5x konsentrasi

·         Masukkan tablet PNP ke dalam botol berlapis aluminium foil tanpa menyentuh tablet.

17.   Cuci plate

·         Buang isi well dengan cepat

·         Isi well dengan larutan PBST. Buang dengan cepat, lalu tepuk-tepukkan pada kertas towel

·         Ulangi 7x lagi

18.   Masukkan 100 µl larutan PNP ke dalam tiap well sesuai peta. Tutup plate dengan aluminium foil.

19.   Inkubasi plate dalam humid box selama 60 menit pada suhu ruang. Masukkan dalam tempat gelap.

20.   Amati perubahan warna. Baca dengan Elisa Reader (absorbansi 450 nm).